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Jacques Gamblin est né à Granville dans la Manche et se passionne très tôt pour la comédie. Après un stage de théâtre au Théâtre National de Bretagne, il devient rapidement régisseur de l’établissement. A 22 ans, il décide de devenir comédien à son tour et fait ses débuts au cinéma en 1988 dans Périgord Noir.
Jacques Gamblin enchaine ensuite les seconds rôles, Il y a des jours… et des lunes, La Belle histoire, A la vie, à la mort !... jusqu’à 1996 où il se fait définitivement un nom avec Pédale Douce pour lequel il est nommé aux Césars, puis Tenue correcte exigée. L’acteur s’illustre alors souvent dans des rôles de personnages tout en émotions, comme dans Au cœur du mensonge, Les Enfants du Marais, ou Mademoiselle.
En 2002, il décroche le Prix d’interprétation au Festival de Berlin pour Laissez-passer, puis est à l’affiche de films plus confidentiels comme Carnages ou 25° en hiver, ou de plus grosses productions comme Les Brigades du tigre, Les Irréductibles, Nos retrouvailles, Enfin veuve, Le premier jour du reste de ta vie, qui lui vaut une nomination au César du meilleur acteur, ou Bellamy.